日前，來(lái)自哥倫比亞大學(xué)、哈弗大學(xué)及美國(guó)國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)局的研究人員報(bào)道了使用蛋白納米孔陣列實(shí)現(xiàn)了單堿基分辨率的實(shí)時(shí)單分子電子DNA測(cè)序，相關(guān)結(jié)果以《Real-Time Single Molecule Electronic DNA Sequencing by Synthesis Using Polymer Tagged Nucleotides on a Nanopore Array》為題發(fā)表在PNAS雜志上。

　　基因測(cè)序是實(shí)現(xiàn)個(gè)性化醫(yī)療和精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)的關(guān)鍵技術(shù)，推動(dòng)了生物醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的快速發(fā)展，完整的個(gè)人基因組序列為醫(yī)療診斷及醫(yī)療保健提供了重要的標(biāo)志和指導(dǎo)方針。目前，獲取高精度序列面臨著成本和速度兩大挑戰(zhàn)。在過(guò)去的十幾年中，測(cè)序取得了很大的進(jìn)展，目前廣泛使用的高通量技術(shù)依賴于對(duì)DNA四個(gè)堿基的光學(xué)檢測(cè)，為了探討可替代的檢測(cè)技術(shù)，逐漸發(fā)展起DNA模板的電子測(cè)序，并應(yīng)用于遺傳學(xué)分析。

　　PNAS和Nature子刊：實(shí)時(shí)單分子電子DNA測(cè)序

　　近兩年開(kāi)發(fā)的納米孔測(cè)序，依賴于單鏈DNA通過(guò)納米孔時(shí)在電壓的作用下產(chǎn)生了可用于序列檢測(cè)的電子信號(hào)，然而，由于DNA四個(gè)堿基的化學(xué)結(jié)構(gòu)非常相似，因此不容易通過(guò)這種方法來(lái)區(qū)分，因此研究者們一直致力于尋找和發(fā)展一個(gè)精準(zhǔn)的單分子電子DNA測(cè)序平臺(tái)，以生產(chǎn)一種小型化的能夠破譯基因組的DNA測(cè)序儀。

　　2012年，研究人員曾在《Scientific Reports》報(bào)道了納米孔測(cè)序單分子邊合成邊測(cè)序（SBS）的原理。如今，研究人員在PNAS上描述了利用完整的SBS系統(tǒng)產(chǎn)生的單堿基水平單分子電子測(cè)序數(shù)據(jù)。SBS系統(tǒng)通過(guò)在四個(gè)堿基分別標(biāo)記上不同的聚合物，聚合酶會(huì)將標(biāo)記的核苷酸添加到DNA鏈上，同時(shí)釋放出聚合物標(biāo)簽，這些標(biāo)簽通過(guò)納米孔時(shí)引起電流變化，根據(jù)不同標(biāo)簽造成的電信號(hào)差異，可以準(zhǔn)確分辨出相應(yīng)的堿基。

　　研究人員將聚合酶栓系在α-hemolysin納米孔上，在芯片上排除納米孔陣列，隨后用多重化的納米孔傳感器搭建了高通量的測(cè)序平臺(tái)，該平臺(tái)使用多聚物標(biāo)記的核苷酸，可在單分子水平上對(duì)多個(gè)DNA模板進(jìn)行平行測(cè)序，通過(guò)這種方式，研究人員獲得了實(shí)時(shí)的單分子測(cè)序數(shù)據(jù)。

　　優(yōu)化措施多，發(fā)展空間大

　　研究人員表示，“納米孔SBS方法的新穎性要從設(shè)計(jì)、合成及四種堿基不同聚合物標(biāo)記的選擇講起，我們用DNA聚合酶共價(jià)連接到納米孔和聚合物標(biāo)記物的堿基上，在DNA復(fù)制過(guò)程中，帶有聚合物標(biāo)記的堿基通過(guò)堿基互補(bǔ)原則連接到待測(cè)序的鏈上，通過(guò)納米孔時(shí)釋放出獨(dú)特的信號(hào)，就是這種獨(dú)特信號(hào)幫助我們實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)單分子測(cè)序，同時(shí)克服了納米孔測(cè)序面臨的障礙。此外，可對(duì)聚合物標(biāo)記的大小、電荷和結(jié)構(gòu)進(jìn)行改進(jìn)，從而實(shí)現(xiàn)最佳分辨率的SBS系統(tǒng)，該項(xiàng)目為精準(zhǔn)醫(yī)學(xué)提供了前所未有的具有成本效益的遺傳診斷平臺(tái)”。

　　據(jù)研究人員表示，目前基于SBS的測(cè)序儀所產(chǎn)生的數(shù)據(jù)遠(yuǎn)遠(yuǎn)超過(guò)PNAS所報(bào)道。最近已經(jīng)實(shí)現(xiàn)了超過(guò)1000個(gè)堿基的讀取長(zhǎng)度。談及未來(lái)，研究人員表示將繼續(xù)調(diào)整連接器及在分子水平上調(diào)整聚合物標(biāo)記的結(jié)構(gòu)和電荷來(lái)優(yōu)化該系統(tǒng)，希望最終能在該系統(tǒng)上實(shí)現(xiàn)準(zhǔn)確、快速和低成本的全人類基因組測(cè)序，并用于常規(guī)的醫(yī)學(xué)診斷。