近期，興證醫(yī)藥健康發(fā)布了一篇關(guān)于三代基因測(cè)序行業(yè)介紹的報(bào)告，動(dòng)脈網(wǎng)認(rèn)為這份報(bào)告有助于醫(yī)療從業(yè)者對(duì)三代測(cè)序技術(shù)和市場(chǎng)前景有一個(gè)全方位的了解，因而進(jìn)行了轉(zhuǎn)載和整理。

　　在“二代測(cè)序”（NGS）尚未迎來(lái)投資熱潮的情況下，技術(shù)突破捷報(bào)連連的“三代測(cè)序”（3GS）又進(jìn)入到了投資人的視野中。1986年，第一臺(tái)商用基因測(cè)序設(shè)備正式出現(xiàn)，到第二代測(cè)序設(shè)備出現(xiàn)，期間間隔了19年時(shí)間。而第二代設(shè)備問(wèn)世，到第三代設(shè)備的誕生，僅僅用了5年，基因測(cè)序設(shè)備的更新?lián)Q代速度正在不斷加快。這就好比“2G”手機(jī)跳過(guò)“3G”，直接跨越到了“4G”時(shí)代。

　　報(bào)告通過(guò)四個(gè)方面對(duì)第三代基因測(cè)試技術(shù)進(jìn)行分析：

　　1.第三代基因測(cè)試技術(shù)的發(fā)展現(xiàn)狀

　　以Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)為代表的三代測(cè)序技術(shù)在經(jīng)過(guò)了多年發(fā)展后，已經(jīng)逐步趨于成熟。

　　盡管當(dāng)下該技術(shù)還有成本偏高、錯(cuò)誤率較高、生物信息學(xué)分析軟件不夠豐富的問(wèn)題，但其在讀長(zhǎng)、測(cè)序速度等方面都具有明顯優(yōu)勢(shì)。

　　三代測(cè)序設(shè)備已實(shí)現(xiàn)穩(wěn)定性、小型化，未來(lái)隨著準(zhǔn)確度提升、平行測(cè)序能力和酶活性等問(wèn)題的解決，第三代測(cè)序技術(shù)將成為未來(lái)發(fā)展的重要技術(shù)趨勢(shì)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化將是大勢(shì)所趨。

　　2.第三代基因測(cè)序方法原理

　　Helicos公司的Heliscope單分子測(cè)序儀、Pacific Biosciences公司的SMRT技術(shù)和Oxford Nanopore Technologies公司的納米孔單分子技術(shù)，被認(rèn)為是第三代測(cè)序技術(shù)。

　　與前兩代技術(shù)相比，他們最大的特點(diǎn)是單分子測(cè)序，其中，Heliscope技術(shù)和SMRT技術(shù)利用熒光信號(hào)進(jìn)行測(cè)序，而納米孔單分子測(cè)序技術(shù)利用不同堿基產(chǎn)生的電信號(hào)進(jìn)行測(cè)序。

　　PacBio SMRT技術(shù)應(yīng)用了邊合成邊測(cè)序的思想，并以SMRT芯片為測(cè)序載體，芯片上有很多小孔，每個(gè)孔中均有DNA聚合酶。

　　測(cè)序基本原理是：DNA聚合酶和模板結(jié)合，4色熒光標(biāo)記4種堿基（即是dNTP），在堿基配對(duì)階段，不同堿基的加入，會(huì)發(fā)出不同光，根據(jù)光的波長(zhǎng)與峰值可判斷進(jìn)入的堿基類(lèi)型。DNA聚合酶是實(shí)現(xiàn)超長(zhǎng)讀長(zhǎng)的關(guān)鍵之一，讀長(zhǎng)主要跟酶的活性保持有關(guān)，它主要受激光對(duì)其造成的損傷所影響。

　　另外，可以通過(guò)檢測(cè)相鄰兩個(gè)堿基之間的測(cè)序時(shí)間，來(lái)檢測(cè)一些堿基修飾情況，既如果堿基存在修飾，則通過(guò)聚合酶時(shí)的速度會(huì)減慢，相鄰兩峰之間的距離增大，可以通過(guò)這個(gè)來(lái)之間檢測(cè)甲基化等信息。SMRT技術(shù)的測(cè)序速度很快，每秒約數(shù)個(gè)dNTP。

　　但是，同時(shí)其測(cè)序錯(cuò)誤率比較高（這幾乎是目前單分子測(cè)序技術(shù)的通?。?，達(dá)到15%。但好在它的出錯(cuò)是隨機(jī)的，并不會(huì)像第二代測(cè)序技術(shù)那樣存在測(cè)序錯(cuò)誤的偏向，因而可以通過(guò)多次測(cè)序來(lái)進(jìn)行有效的糾錯(cuò)（代價(jià)是重復(fù)測(cè)序，也就是成本會(huì)增加）。

　　SMRT技術(shù)原理圖

　　Oxford Nanopore Technologies公司所開(kāi)發(fā)的納米單分子測(cè)序技術(shù)與以往的測(cè)序技術(shù)皆不同，它是基于電信號(hào)而不是光信號(hào)的測(cè)序技術(shù)。

　　該技術(shù)的關(guān)鍵之一是，設(shè)計(jì)了一種特殊的納米孔（只能容納單分子通過(guò)），孔內(nèi)共價(jià)結(jié)合有分子接頭。當(dāng)DNA堿基通過(guò)納米孔時(shí)，它們使電荷發(fā)生變化，從而短暫地影響流過(guò)納米孔的電流強(qiáng)度（每種堿基所影響的電流變化幅度是不同的），靈敏的電子設(shè)備檢測(cè)到這些變化從而鑒定所通過(guò)的堿基。

　　Nanopore技術(shù)原理圖

　　3.第三代基因測(cè)序技術(shù)的優(yōu)勢(shì)和劣勢(shì)

　　相比于二代測(cè)序，三代測(cè)序具有如下優(yōu)勢(shì)：

　　1.第三代基因測(cè)序讀長(zhǎng)較長(zhǎng)。如Pacific Biosciences公司的PACBIO RS II 的平均讀長(zhǎng)達(dá)到10kb，可以減少生物信息學(xué)中的拼接成本，也節(jié)省了內(nèi)存和計(jì)算時(shí)間。

　　2.直接對(duì)原始DNA樣本進(jìn)行測(cè)序，從作用原理上避免了PCR擴(kuò)增帶來(lái)的出錯(cuò)。

　　3.拓展了測(cè)序技術(shù)的應(yīng)用領(lǐng)域。二代測(cè)序技術(shù)大部分應(yīng)用基于DNA，三代測(cè)序還有兩個(gè)應(yīng)用是二代測(cè)序所不具備的：第一個(gè)是直接測(cè)RNA的序列，RNA的直接測(cè)序，將大大降低體外逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)生的系統(tǒng)誤差。第二個(gè)是直接測(cè)甲基化的DNA序列。實(shí)際上DNA聚合酶復(fù)制A、T、C、G的速度是不一樣的。正常的C或者甲基化的C為模板，DNA聚合酶停頓的時(shí)間不同，根據(jù)這個(gè)不同的時(shí)間，可以判斷模板的C是否甲基化。

　　4.三代測(cè)序在ctDNA，單細(xì)胞測(cè)序中具有很大的優(yōu)勢(shì)：ctDNA含量非常低，三代測(cè)序技術(shù)靈敏度高，能夠?qū)τ?ng以下做到監(jiān)測(cè)；在單細(xì)胞級(jí)別：二代測(cè)序要把DNA提取出來(lái)打碎測(cè)序，三代測(cè)序直接對(duì)原始DNA測(cè)序，細(xì)胞裂解原位測(cè)序，是三代測(cè)序的殺手應(yīng)用。

　　同時(shí)，第三代基因測(cè)序也存在一定的缺陷：

　　1.總體上單讀長(zhǎng)的錯(cuò)誤率依然偏高，成為限制其商業(yè)應(yīng)用開(kāi)展的重要原因；第三代基因測(cè)序技術(shù)目前的錯(cuò)誤率在15%-40%，極大地高于二代測(cè)序技術(shù)NGS的錯(cuò)誤率（低于1%）。不過(guò)好在三代的錯(cuò)誤是完全隨機(jī)發(fā)生的，可以靠覆蓋度來(lái)糾錯(cuò)（但這要增加測(cè)序成本）。

　　2.三代測(cè)序技術(shù)依賴(lài)DNA聚合酶的活性。

　　3.成本較高，二代Illumina的測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.05-0.15美元，三代測(cè)序成本是每100萬(wàn)個(gè)堿基0.33-1.00美元。

　　4.生信分析軟件也不夠豐富（如圖所示）：

　　一、二、三代基因測(cè)序技術(shù)對(duì)比圖

　　4.國(guó)內(nèi)外布局三代測(cè)序的公司情況

　　國(guó)外布局三代測(cè)序的主要有Pacific Biosciences、Oxford Nanopore Technologies等公司，2015年10月27日，國(guó)內(nèi)公司瀚?；颍―irect Genomics）公布了基于Helicos技術(shù)研發(fā)的專(zhuān)門(mén)用于臨床的第三代單分子測(cè)序儀GenoCare 原理樣機(jī)。

　　中科院北京基因組研究所與浪潮基因組科學(xué)也在共同研制國(guó)產(chǎn)第三代基因測(cè)序儀。在測(cè)序儀價(jià)格方面，PACBIO 2011年的第一臺(tái)三代測(cè)序儀PacBioRS在美國(guó)價(jià)格80萬(wàn)美金，2015年生產(chǎn)的sequel測(cè)序儀價(jià)格35萬(wàn)美金，大幅下降。在測(cè)序成本方面，預(yù)計(jì)未來(lái)5年內(nèi)三代測(cè)序能達(dá)到100美元全基因組測(cè)序的價(jià)格。

　　國(guó)內(nèi)外布局三代測(cè)序的公司

　　第三代測(cè)序技術(shù)是大勢(shì)所趨

　　從興證醫(yī)藥健康這份報(bào)告中可以看到：目前，第三代測(cè)序在技術(shù)上相對(duì)于二代在讀長(zhǎng)和測(cè)序速度等方面有明顯優(yōu)勢(shì)，但在成本和準(zhǔn)確率等方面還有待提升。目前國(guó)內(nèi)只有瀚?；蛟谌鷾y(cè)序上有臨床成果，而國(guó)外已經(jīng)初步實(shí)現(xiàn)技術(shù)商業(yè)化?？傮w而言，第三代測(cè)序技術(shù)是未來(lái)發(fā)展趨勢(shì)，實(shí)現(xiàn)大規(guī)模商業(yè)化將是大勢(shì)所趨。